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1、蛋白质含量测定法蛋白质含量测定法,是生物化学讨论中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(BiUret法Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外汲取法。此外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外汲取法灵敏1020倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较简单,但较精确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得留意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,由于一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种
2、测定法都不是完善无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:试验对测定所要求的灵敏度和精确度;蛋白质的性质;溶液中存在的干扰物质;测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏(Kjeldahl)定氟法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,依据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:CH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)NH22NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4(2)(NH4)
3、2SO4+2Na0H2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反应(11(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸储装置中进行。为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。试验?口计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。五种蛋白质测定方法比较如下:方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低,费时将蛋白氮转化非蛋白氮用于标准蛋白(Kjedahl适用于810为氨,用酸汲(可用三氯质含量的精确法)0.2小时取后滴定乙酸
4、沉淀蛋测定;干扰少;1.0mg氮,白质而分费时太长误差为2%别)双缩版法灵敏度低中速多肽键+碱性硫酸钱;用于快速测(Biuretl-20mg203Cu2+紫色络TriS缓冲液;定,但不太灵法)O分钟合物某些氨基酸敏;不同蛋白质显色相像紫外汲取法较为灵敏快速蛋白质中的酪各种瞟吟和用于层析柱流50100g510氨酸和色氨酸嗑咤;出液的检测;分钟残基在各种核甘酸核酸的汲取可280nm处的以校正光汲取Folin-酚灵敏度高慢速双缩服反应;硫酸镂;耗费时间长;试剂法5g40磷铝酸-磷铝TriS缓冲液;操作要严格计(Lowry60酸试剂被Tyr甘氨酸;时;法)涉和Phe还原各种硫醇颜色深浅随不同蛋白质变化
5、考马斯亮蓝灵敏度最高快速考马斯亮蓝染强碱性缓冲最好的方法;法15g515料与蛋白质结液;干扰物质少;(Bradford分钟合时,其maxTritonX-IO颜色稳定;法)由465nm变为595nm0;SDS颜色深浅随不同蛋白质变化二、双缩眠法(BiIIret法)(一)试验原理双缩版(nh3conhconh3)是两个分子版经180。C左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩版与CUSO4形成紫色络合物,称为双缩服反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩版反应。R-CHCH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成
6、正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为l10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸钺、TriS缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩腑法常用于需要快速,但并不需要非常精确的蛋白质测定。(二)试剂与器材1 .试剂:(1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mgml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度Img/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再依据其纯度,称量配制成标准
7、蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制,酪蛋白用O.05NNaOH配制。(2)双缩版试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4-SH2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6AH2O),用500毫升水溶解在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中I此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀消失,则需要重新配制。2 .器材:可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。(三)操作方法1.标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩版试
8、剂。充分摇匀后,在室温(2025C)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对比液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光汲取值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定:取23个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。留意样品浓度不要超过10mgmlo三、FOlin一酚试剂法(Lowry法)(一)试验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来渐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩版方法是相同的,只是加入了其次种试剂,即FOIin-酚试剂,以增加显色量,
9、从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的缘由是:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin一酚试剂中的磷铝酸盐一磷锯酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(祖兰和铝兰的混合物在肯定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。Folin一酚试剂法最早由LoWry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩眠法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确掌握操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩版反应发生干扰的离子,同样简单干扰Lowry反应。而小寸后者的影响还要大得多。酚类、柠
10、檬酸、硫酸镀、TriS缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醛(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必需作校正曲线。含硫酸筱的溶液,只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必需提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度12倍。进行测定时,加FOIin一酚试剂时要特殊当心,由于该试剂仅在酸性PH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的状况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜一蛋白质溶液中时,必需马上混匀,以便在磷铝酸一磷铝酸试剂被破坏之
11、前,还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5g0通常测定范围是20250g0(二)试剂与器材1.试剂(1)试剂甲:(A) 10克Na2CO32克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6AH2O1溶解于500毫升蒸储水中。(B) 0.5克硫酸铜(CuSO4SH2O)溶解于100毫升蒸储水中,每次使用前,将50份(八)与1份(B)混合,即为试剂甲。(2)试剂乙:在2升磨口回流瓶中,加入100克铸酸钠(Na2W042H20),25克铝酸钠(Na2Mo42H2O)及700毫升蒸储水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以
12、小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂(Li2SO4),50毫升蒸储水及数滴液体漠,开口连续沸腾15分钟,以便驱除过度的澳。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体漠的步骤稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定,酚酥作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为IN左右。(3)标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或y一球蛋白,溶于蒸储水,浓度为250gml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用09%NaCI溶液。2.器材(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)秒表(4)试管16支(三)操作方法1.标准曲线的测定:取16支大试管,1支作
13、空白,3支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入O,0l,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250gml用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上快速混合,于室温(2025)放置10分钟。再逐管加入0.5墓升试剂乙(Folin一酚试剂),同样马上混匀。这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对比,于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。留意:因Lowry反应的显色随时间不断深入,因此各项操作必需精确掌握时间,即第1支试管
14、加入5毫升试剂甲后,开头计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲,2分钟后加第3支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可马上加入05毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管,余此类推。待最终一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开头测定光汲取。每分钟测一个样品。进行多试管操作时,为了防止出错,每位同学都必需在试验纪录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的挨次,逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。F。Iin一酚试剂法试验表格:管号1234567891c
15、)标准蛋白质00.10.20.40.60.81.0(250gml)未知蛋白质0.20.40.6(约250gml)蒸储水1.00.90.80.60.40.200.80.60.4试剂甲5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0试剂乙0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5每管中蛋白质的量(g)吸光度值(A7OO)2.样品的测定:取1毫升样品溶液(其中约含蛋白质20250微克),按上述方法进行操作,取1毫升蒸储水代替样品作为空白对比。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起,同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面,再增加3个试管。如上表中的8、9、IOiSfi
16、fe依据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。留意,由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质四、改良的简易FOIin一酚试剂法(一)试剂1 .试剂甲:碱性铜试剂溶液中,含05NNaOHs10%Na2CO3s0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜,配制时留意硫酸铜用少量蒸储水溶解后,最终加入。2 .试剂乙:与前面的基本法相同。临用时加蒸储水稀释8倍。3 .标准蛋白质溶液:同基本法。(二)操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为
17、1毫升,室温放置10分钟后,试剂乙改为4毫升。在55。C恒温水浴中保温5分钟。用流淌水冷却后,在660nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法,可获得与FOlin一酚试剂法(即LoWry基本法)相接近的结果。五、考马斯亮兰法(Bradford法)(一)试验原理双缩版法(Biuret法)和FoIin一酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和很多限制,促使科学家们去查找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法),是依据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白
18、质测定法。考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大汲取峰的位置(ma),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经讨论认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特殊是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是:(1)灵敏度高,据估量比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达lgo这是由于蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光汲取值随蛋白质浓度的变化比LOWry法要大的多。(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只
19、需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地掌握时间。(3)干扰物质少。如干扰Le)Wry法的K+、Na+、Mg2+离子、TriS缓冲液、糖和蔗糖、甘油、筑基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是:(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用7球蛋白为标准蛋白质,以削减这方面的偏差。(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、TritonX-
20、100.十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOHo(犹如0.1N的酸干扰Lowary法一样(3)标准曲线也有稍微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。(二)试剂与器材1 .试剂:(1)标准蛋白质溶液,用Y一球蛋白或牛血清清蛋白(BSA),配制成1.0mgml和0.1mgml的标准蛋白质溶液。(2港马斯亮兰G250染料试剂称100mg考马斯亮兰G250溶于50ml95%的乙醇后,再加入12Oml85%的磷酸,用水稀释至1升。2 .器材:(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)试管16支()操作方法1.标准方法(1)取16支试管,1支作空白,3支
21、留作未知样品,其余试管分为两组按表中挨次,分别加入样品、水和试剂,即用l0mgml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01.0.02、0.04.0.06、0.08.0.1ml,然后用无离子水补充到0.1ml。最终各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G-250试剂,每加完一管,马上在旋涡混合器上混合(留意不要太猛烈以免产生大量气泡而难于消退、未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。(2)加完试剂25分钟后,即可开头用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光汲取值A595,空白对比为第1号试管,即O.lmlKO加5.0mlG-250试剂。留意:不行使用石英比色皿(因不易洗去染色
22、),可用塑料或坡璃比色皿,使用后马上用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不行用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法试验表格:管号123456789K)标准蛋白质O0.01(1.0mgml)未知蛋白质(约1.0mgml)0.020.085.00.040.060.080.100.060.040.025.05.05.00.02O5.00.040.085.00.060.065.0蒸储水0l0.04考马斯亮蓝G-250试剂5.05.00.095.0每管中的蛋白质量(g)光汲取值(As95)(3)用标准蛋白质量(g)为横座标,用吸光度值A595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线。由此标准曲线,依
23、据测出的未知样品的A595值,即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100gml),可将取样量(包括补加的水)加大至I0.5ml或LOmL空白对比则分别为0.5ml或1.0mlH2O,考马斯亮蓝G250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线,测定595nm的光汲取值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29o六、紫外汲取法蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共较双键,使蛋白质具有汲取紫外光的性质。汲取高峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238
24、nm的光汲取值与肽键含量成正比。采用肯定波长下,蛋白质溶液的光汲取值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。紫外汲取法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特殊适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,由于此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其肯定值。此法的特点是测定蛋白质含量的精确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有肯定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相像的蛋白质。若样品中含有瞟岭、嗑碇及核酸等汲取紫外光的物质,
25、会消失较大的干扰。核酸的干扰可以通过杳校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是由于不同的蛋白质和核酸的紫外汲取是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在肯定的误差。此外,进行紫外汲取法测定时,由于蛋白质汲取高峰常因PH的转变而有变化,因此要留意溶液的PH值,测定样品时的PH要与测定标准曲线的PH相全都。下面介绍四种紫外汲取法:1. 280nm的光汲取法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在28Onm处具有最大汲取,且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大,因此测定蛋白质溶液在28Onm处的吸光度值是最常用的紫外汲取法。测定时,将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中,用配制蛋白质溶液的溶剂
26、(水或缓冲液)作空白对比,在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280o蛋白质浓度可掌握在0.11.0mgml左右。通常用Icm光径的标准石英比色皿,盛有浓度为lmg/ml的蛋白质溶液时,A280约为LO左右。由此可马上计算出蛋白质的大致浓度。很多蛋白质在肯定浓度和肯定波长下的光汲取值(Al%km)有文献数据可查,依据此光汲取值可以较精确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与(Al%km)值(即蛋白质溶液浓度为1%,光径为Icm时的光汲取值)的关系。文献值Ai%icm,人称为百分汲取系数或比汲取系数。蛋白质浓度=(A28010)/Al%km,280nm(mgml)(V1%浓度10mg
27、ml)例:牛血清清蛋白:Ai%km=6.3(280nm)溶菌酶:A1%icm=22.8 (280nm)若查不到待测蛋白质的Al%km值,则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质,用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为LOmg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(BSA标准曲线的测定:取6支试管,按下表编号并加入试剂:管号123456BSA(1.0mgml)O1.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.0OA280用第1管为空白对比,各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280,以A280为纵座标,各管的蛋白质浓度或蛋白质量(m
28、g)为横座标作图,标准曲线应为直线,采用此标准曲线,依据测出的未知样品的A280值,即可查出未知样品的蛋白质含量,也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1lcm,280nm2. 280nm和260nm的汲取差法核酸对紫外光有很强的汲取,在280nm处的汲取比蛋白质强IO倍(每克),但核酸在260nm处的汲取更强,其汲取高峰在260nm四周。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍,而蛋白质则相反,280nm紫外汲取值大于260nm的汲取值。通常:纯蛋白质的光汲取比值:A280A2601.8纯核酸的光汲取比值:A280A2600.5含有核酸的蛋白质溶液,可分
29、别测定其A280和A260,由此汲取差值,用下面的阅历公式,即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=L45A280-O.74A26o(mgml)此阅历公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母蟠醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。3. 215nm与225nm的汲取差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光汲取测定时,可用215nm与225nm汲取值之差,通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质,配制成20100gml的一系列5.0ml的蛋白质溶液,分别测定215nm和225nm的吸光度值,并计算出汲取差:汲取差:A215-A225以汲取差为纵座
30、标,蛋白质浓度为横座标,绘出标准曲线。再测出未知样品的汲取差,即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20100gml范围内,蛋白质浓度与吸光度成正比,NaCL(NH4)2SCU以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液,都无显著干扰作用,但是0.1NNaoH,0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光汲取值较大,必需将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。4. 肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光汲取的强弱,与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50500gml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液,测定238nm的光汲取值A238,以A238为纵座标,蛋白质含量为横座标,绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。进行蛋白质溶液的柱层析分别时,洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。本方法比28Onm汲取法灵敏。但多种有机物,如醇、酮、醛、酰、有机酸、酰胺扫一扫,有福利类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐,无机麻口水溶液进行测定。若含有有机溶剂,可先将样品蒸干,或用其他方法除去干扰物质,然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。广州然科生物科技有限公司1GuangzhouRankeBiotechCo.,Ltd.联系方式:联系人:李经理手机:15902040850邮箱:rankebioQQ:1046485526网址: