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1、1,分子生物学诊断技术进展,2,主要内容：,分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用简单介绍实验原理以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例分子诊断技术在以下病原研究的应用进展乙型肝炎丙型肝炎结核分枝杆菌,3,病原学检测常用的实验室技术,细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验血清学、免疫学诊断技术电镜技术分子生物学诊断技术,4,分子生物学诊断技术方法简介,5,分子诊断技术方法简介,2、多标靶同时检测多重PCR毛细管电泳以测序分析为基础的检测技术,6,分子诊断技术方法简介,3、核酸杂交DNA荧光原位杂交（FISH）将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆
2、抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。线性探针分析法（LiPA）杂交保护分析法（HPA）4、质谱利用色、质谱结合PCR技术,7,分子诊断的功能及扩展,病原的诊断和鉴别诊断病原分型病毒载量监测-个体化治疗的依据疗效及预后标志其他：病原感染中发生、发展各阶段,8,分子诊断的功能及扩展,疾病分型及意义例如：HPV（30/100）高危-16，18，31，45 低危-6，11,9,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗 例1.,-北京地坛医院谢尧提供,10,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗例2.HBV-干扰素HBV100pg/mL 1/30 阴转(HBeAg HBeAb
3、),11,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗例3.HIV病毒载量与传播15127人 流行病学调查415对伴侣30个月HIV阳转22%（90/415）51人RNA1500copies/mL 全阴,12,分子诊断的功能及扩展,病毒载量与治疗例4.血浆EBV载量与鼻咽癌复发15个二年持续缓解：0 copy/mL10个复发：32250 copies/mL17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高,13,耐药病原的分子诊断,WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用HBV的YMDD变异HIV耐药,14,血制品筛查,300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：HBV：47HCV：10HIV-1：2-2001年
4、剑桥资料 HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6%-Am.J.Chin Athol.2000,15,在基础研究领域中的应用；遗传病的基因诊断和产前基因诊断：如血友病、地中海贫血等肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测；骨髓移植、器官移植供体配型选择；法医学、动植物学、古人类学、古生物学；与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；药物基因组学、耐药基因的检测，等等,分子生物学技术在其它领域的应用,16,简单介绍实验原理,PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)荧光实时定量PCR（real time PCR）NASBA（依赖核酸
5、序列的扩增）,17,PCR原理:实质就是体外基因复制技术,加热变性95 C,靶序列引物退火55 C,引物延伸72 C,18,PCR 循环 第一步 加热变性,靶序列,靶序列,从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94下热变性1-4分钟，使之解为单链。,19,PCR 循环第二步引物与靶序列退火,靶序列,靶序列,Primer 1,Primer 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5,3,5,3,3,引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55左右,20,PCR 循环
6、第三步-引物延伸,靶序列,靶序列,Primer 1,Primer 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNAPolymerase,在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3端A开始,沿着53的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72左右,21,第1个PCR循环完成后,靶序列,靶序列,Biotin,Biotin,22,30次循环后靶序列扩增的数量,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,1 cycle=2 Amp
7、licon,2 cycle=4 Amplicon,3 cycle=8 Amplicon,4 cycle=16 Amplicon,5 cycle=32 Amplicon,6 cycle=64 Amplicon,7 cycle=128 Amplicon,23,探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。,荧光PCR原理 TaqManTM技术,24,Extension Step,1.Strand Displacement,2.Cleavage,3.PolymerizationComplete,4.Detection,l,荧光PCR原理 TaqMa
8、nTM技术,25,定量PCR测定的是扩增的指数扩增期;定性PCR测定的是扩增的终点（平台期）,定量PCR与定性PCR测定的区别,26,市场上常见的实时荧光PCR仪,27,临床标本,核酸提取技术,NASBA 扩增,ECL-化学发光标记检测,NASBA 扩增+分子灯塔检测扩增过程中“分子灯塔”即时同相检测,方法 1-NucliSens ECL,方法 2-NucliSens EasyQ,加入裂解缓冲液和内置标准,NASBA测定原理,28,NASBA扩增原理,引物 1,逆转录酶,RNase H引物 2,逆转录酶,T7 RNA 聚合 酶,引物 2,逆转录酶,逆转录酶,RNase H引物 1,线性循环,扩
9、增循环,29,NASBA 和 PCR 的不同,NASBA扩增目标为RNA同温扩增连续扩增扩增物为单链RNA引物次序不包含於最终产物中,PCR扩增目标为DNA温度循环扩增循环扩增扩增物为双链DNA引物次序包含於最终产物中,30,乙型肝炎检测标志物：HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc(IgG,IgM),HBV-DNA,Dane颗粒（完整的病毒）形态,乙型肝炎的分子诊断,31,乙型肝炎的分子诊断,1.重要性全球 20亿人感染慢性 3.5亿人中国、东南亚、非洲50肝硬化，70-90肝癌7-30携带者感染变异体,32,2.HBV基因型与血清型关系及流行病学分布基因型与血清型不完全一
10、致临床突变率不同有地域分布特点,乙型肝炎的分子诊断,33,表1：,34,表1(续）:,35,3.基因型与临床实验室表现不同（表2）病情与转归：C较B差抗病毒治疗：A优于D B优于C adw/ayw 20:1,乙型肝炎的分子诊断,36,表2:,37,4.一般实验室分型方法测序PCR-RELP（限制性片断长度多态性）PCR核酸杂交（谱线探针法）血清学：单抗可区分A-F各基因型,乙型肝炎的分子诊断,38,5.抗病毒治疗的耐药性问题拉米夫定耐药性的检测,乙型肝炎的分子诊断,39,拉米夫定耐药性的检测耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸变异有关I型：YMDD变异为HBV聚合酶基因(P区基因
11、)区第741个核苷酸位,A-G置换，使第552个密码子蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)取代，成为YVDD变异II型：YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G-T置换，使第55个密码子蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)取代，成为YIDD变异 YMDD变异：Y（酪氨酸）M（蛋氨酸）V（缬）：YVDD变异 D（天冬氨酸）I（异亮）：YIDD变异 D（天冬氨酸）最近报道：YSDD（ATG AGT）应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点,乙型肝炎的分子诊断,40,乙型肝炎的分子诊断,41,乙型肝炎的分子诊断,42,HCV的基因型/亚型,6个型，68个亚型,1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m2a,
12、b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t5a6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n,丙型肝炎的分子诊断,43,HCV基因分型方法,测序型特异性引物PCR分型法 线性探针杂交（InnoLipa)限制性片段长度多态性分析（RFLP）TRUGENE HCV 5NC Genotyping Assay,丙型肝炎的分子诊断,44,5UTR(5Non-Coding Region)高度保守HCV RNA诊断实验的常用区域有一套良好的多态性特征，因此可用于基因分型 许多HCV分型商业试剂盒都采
13、用该区进行分型TRUGENE HCV 5NC Genotyping AssayVERSANT HCV Genotyping Assay(LiPA),HCV NS5B区各亚型间基因差异较大扩增效率较低若成功扩增，序列分析可区别HCV各亚型。,HCV基因分型常选用的区域,丙型肝炎的分子诊断,45,临床工作,目前常用的基因型检测方法（RFLP,InnoLipa,Trugene)通常建立在5非编码区，因为该区序列保守，检测灵敏度高，是HCV RNA诊断实验的常用区域。在临床工作中，对5UTR进行分型的RFLP,InnoLipa,Trugene分型都可以满足分型的需要，为制定治疗方案和判断预后提供指导。
14、常只需将1型和4型与其它基因型相区别，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量，因此上述的任何一种方法均可以采用。,丙型肝炎的分子诊断,46,HCV 5UTR gene,Second PCR product=257bp,Scheme A,Cleavage with BsrB,Hinfand Hae,93 and 91bp,Genotype 2a and 2b,257bp,Genotype 3b,4a and 5a,127 and 91bp,104,74bp,160,74bp,2a,2b,160,74bp,234bp,3b,4a and 5a,Cleavage with Hae,Scheme C,
15、Cleavage with Apo,183,74bp,257bp,4a,1b,197bp,Genotype 1a,1b and 6a,166/169 and 91bp,Cleavage with BstU,Scheme B,1a,227bp,5a,Genotype3a,6a,257bp,HCV 5非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图,-北京大学人民医院肝病研究所提供,47,抗HCV的确认实验确认的重要性（灰区的遗漏）目的：解决血液筛查实验（如ELISA）的非特异性问题方法：例如：PCR 活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法RIBA 3.0 抗体的确认新流程：,丙型肝炎的分子诊断,48,抗
16、-HCV筛查检测,报告,阴性,或,根据S/Co比值判定为阳性,所有阳性结果,高S/Co比值阳性*,报告,低S/Co比值阳性*,RIBA HCV检测,或,阳性,报告,阴性,报告,不确定,报告,阳性,阴性,RIBA HCV检测,HCV RNA的NAT检测,阳性,报告,阴性,报告,不确定,报告,报告,*以S/Co 3.8(OCD HCV ELISA 3.0)或 8.0(OCD VITROS ECi/ECiQ HCV)为“界值”。,CDC抗-HCV实验室检测结果报告导则,49,靶序列来源:a.单抗检出的TB抗原蛋白编码基因b.TB特异性核酸片段克隆c.插入序列,结核分枝杆菌(TB)的分子诊断TB 检测
17、,实验设计特点,50,65KD，165bp;MPB64，240bp;IS6110，123bp;IS986，245bp;16sDNA，584bp.,举例,结核分枝杆菌(TB)的分子诊断TB 检测,51,标本处理：痰液化，抑制物去除 试剂质控及灵敏度,注意事项,结核分枝杆菌(TB)的分子诊断TB 检测,52,结核的PCR临床主要应用 a.结核与其他分枝杆菌区分 b.结核耐药基因 c.对含菌量低的标本的分离 d.为临床可疑者捕捉信息,临床评价,结核分枝杆菌(TB)的分子诊断TB 检测,53,PCR方法与痰涂片及TB培养的比较 应做比对研究,临床评价,结核分枝杆菌(TB)的分子诊断TB 检测,54,R
18、FP（利福平）INH（异烟肼）SM（链霉素）EMB（乙胺丁醇）PZA（吡嗪酰胺）喹诺酮类,已确定的耐药的抗结核药物,结核分枝杆菌(TB)的分子诊断耐药监测,55,单耐药基因检测,耐利福平：突变一般发生在RNA聚合酶B亚单位编码基因（rpoB基因）突变位点：531位 丝氨酸亮氨酸526位 组氨酸酪氨酸突变导致RFP 不能与RNA聚合酶B亚单位结合耐异烟肼：与三种基因突变有关katG基因（突变位点：463位 精氨酸亮氨酸）inhA基因（突变位点：94位 丝氨酸丙氨酸）ahpC基因,结核分枝杆菌(TB)的分子诊断耐药监测,56,同时对利福平、异烟肼这两种或以上的抗结核药物耐药大多数耐多药菌株是各种药
19、物作用靶分子的编码基因逐步突变所致;靶结构变化与耐药水平有关少数耐多药菌株是由一个耐多药位点的突变所致,耐多药基因检测,结核分枝杆菌(TB)的分子诊断耐药监测,57,样品的制备PCR扩增已知的与耐药有关的基因片段扩增产物耐药基因分析SSCP（单链构象多态性分析）RFLP（限制性片段长度多态性分析）DNA序列分析,耐药基因的检测方法,结核分枝杆菌(TB)的分子诊断耐药监测,58,需面对的问题,高费用感染与患病与传统医学的矛盾技术本身的缺陷（污染、生物安全）,59,其它需要关注的问题：,标本采集、运送和保存：供分离病毒、检出核酸及抗原的标本，要求做到：1.早：特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本。2.快：病毒离活体后在室温下很易死亡，故采得标本应尽快送检。不能及时检测的标本应放入装有冰块或干冰的容器内送检。短时间可低温保存，冻存的标本忌反复冻融。3.近：用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本应尽量取自病变部位或接近病变部位(如脑炎取脑脊液，腹泻取粪便，呼吸道感染取鼻咽分泌物或支气管灌洗液，有病毒血症时采取血液)。4.多：标本的量不能太少，如有可能一次取多种标本，在病程急性期和恢复期都取标本。5.净：避免污染标本，特别是用于病毒分离或PCR检测的标本实验室生物安全保护实验室室内、室间质量控制,
