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1、中国实验动物学会团体标准实验动物鸭甲型肝炎病毒3型检测方法编制说明中国实验动物学会团体标准实验动物鸭甲型肝炎病毒3型检测方法编制说明一、任务来源本标准由中国实验动物学会提出，中国实验动物学会实验动物标准化技术委员会归口，根据中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会(以下简称专委会)有关文件及GB/T16733国家标准制定程序的阶段划分及代码和采用快速程序制定国家标准的管理规定的要求，结合实验动物专业具体情况，特制定本工作程序。由吉林大学和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责起草。二、主要工作过程收集国内外鸭甲型肝炎病毒相关标准及相关资料数据的整理、分析，为整理鸭甲型肝炎病毒3型检测方法提供基础参
2、数。查找已经公布的鸭甲型肝炎病毒3型的基因序列，设计引物，建立RT-PCR检测方法，并对方法的特异性，敏感性，重复性等进行验证。另外根据基因序列，结合参考文献，建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，优化引物和探针序列，优化反应条件，建立标准曲线，并对方法的特异性，敏感性，重复性等进行验证。结合国内外标准及相关资料，形成送审稿。三、标准编写背景鸭病毒性肝炎(DUCkVirusHepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(DUCkHepatitisVirus,DIIV)引起的一种对雏鸭高致死率的急性传染病。I型鸭肝炎病毒又称为鸭甲型肝炎病毒(DuckHepatitisAVirus,DIIAV
3、),属于小RNA病毒科，主要包括3个基因型，分别为传统的鸭甲型肝炎病毒1型(DlIAV-I),仅在台湾报道过的血清型为鸭甲型肝炎病毒2型(DHAV-2),和近年来在中国和韩国出现的一种新血清型即鸭甲型肝炎病毒3型(D1IAV-3)o我国现状是DHAV-I与DHAV-3同时流行，DHAV-I已有上市疫苗可得到控制，但DHAV-3无上市疫苗。DHA”3目前已成为我国鸭肝炎病毒主要流行毒株，给养鸭业带来严重的经济损失。目前我国国家标准中没有对鸭肝炎病毒检测方法的规定。我国仅有中华人民共和国农业行业标准NY/T554-2002鸭病毒性肝炎诊断技术，距今已有近20年。我们团队在2017年获得的中国实验动
4、物学会团体标准T/CALAS18-2017实验动物SPF鸭微生物学监测总则和T/CALAS14-2017实验动物I型鸭肝炎病毒检测方法中规定的I型鸭肝炎病毒是指鸭甲型肝炎病毒1型。目前，我国SPF鸭群排除的微生物病原没有包括鸭甲型肝炎病毒3型，急需相应的标准，用于指导实验动物鸭微生物学净化。本项目是由吉林大学和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主持承担并完成。通过收集、整理、汇总国内外有关资料，参照OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册2.7.9和川/丁554-2002进行修订补充，制定团体标准。四、标准编写原则鸭甲型肝炎病毒感染导致雏鸭的急性和高度致死性传染病，主要感染3周龄以下雏鸭，死亡率较高。鸭甲
5、型肝炎病毒1型是传统毒株，在世界范围内流行。近年来，我国新发的鸭甲型肝炎病毒3型，已成为我国主要流行毒株。世界动物卫生组织公布的陆生动物诊断试验和疫苗手册详细规定了鸭肝炎病毒的诊断方法。结合我国农业行业标准NY/T554-2002鸭病毒性肝炎诊断技术，制定实验动物团体标准。五、标准主要技术内容说明1 .标准内容雏鸭接种、鸭（鸡）胚接种、原代鸭胚肝细胞接种与世界动物卫生组织公布的陆生动物诊断试验和疫苗手册中描述一致。2 .本标准参照中华人民共和国农业行业标准NY/T554-2002。本标准适用于鸭甲型肝炎病毒3型的诊断及检疫。3 .本标准增加RT-PCR检测方法。利用分子生物学手段RT-PCR方
6、法快速检测鸭甲型肝炎病毒3型病原。按照RNAiSOPIUS试剂说明书提取鸭甲型肝炎病毒3型RNA,反转录后，进行PCR,根据判定标准确定阴阳性。4 .本标准增加荧光定量RT-PCR检测方法。利用分子生物学手段荧光定量RT-PCR方法快速检测鸭甲型肝炎病毒3型病原。按照市售的一步法荧光定量PCR试剂说明书，对提取鸭甲型肝炎病毒3型RNA,进行定量PCR,根据判定标准确定阴阳性。六、主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果;本标准的内容包括3部分，其中第一部分参照OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册2.7.9和NY/T554-2002鸭病毒性肝炎诊断技术。第二部分RT-PCR检
7、测是根据NCBl中公布的鸭甲型肝炎病毒3型的保守基因序列设计引物并合成，建立RT-PCR检测方法，摸索引物浓度、退火温度等反应条件，确定该方法的特异性好,敏感性高。应用该方法检测临床样本。与病毒分离的结果一致。第三部分荧光定量RT-PCR检测，是在文献（李井新，2013.鸭甲型肝炎病毒1型和3型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其在雏鸭体内动态分布规律的研究D）基础上，优化引物和探针序列，优化反应条件，建立标准曲线，该方法特异性好，对番鸭细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、禽呼肠弧病毒、鸭甲肝病毒1型等病毒检测，均无荧光信号。而且其灵敏度高，对DHAV-3的最小检出量均为10
8、0拷贝。近年来，鸭甲型肝炎病毒3型严重危害雏鸭，病死率极高，对我国养鸭业造成严重损失，因此该标准用于对该病的快速诊断，预防该病，将带来巨大的经济效果。七、采用国际标准或国外先进标准的程度，以及国内外同类标准水平的对比情况国家标准中没有对鸭甲型肝炎病毒3型检测方法的规定。本标准在编制过程中参照了OIE陆生动物卫生法典2.7.9相应的方法，与其一致，同时也参照了NY/T554-2002鸭病毒性肝炎诊断技术相关内容。所以，本标准中参考的试验方法与国际接轨。八、与有关的现行法律、法规和强制性标准的关系本标准的编写在格式上采用GB/T1.1-2009标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则的规定。本
9、部分根据我国农业行业标准NY/T554-2002鸭病毒性肝炎诊断技术和OIE陆生动物卫生法典相关内容的规定。我国实验动物学会团体标准T/CALAS18-2017实验动物SPF鸭微生物学监测总则中规定的鸭病毒性肝炎的病原指的是鸭甲型肝炎病毒1型。同时在T/CALAS14-2017实验动物SPF鸭I型鸭肝炎病毒检测技术规定了鸭甲型肝炎病毒1型的检测方法。本标准的编写也是对团体标准T/CALAS18-2017实验动物SPF鸭微生物学监测总则的补充和完善。九、重大意见分歧的处理依据和结果无十、作为强制性标准或推荐性标准的建议本标准建议，鸭甲型肝炎病毒3型的检测方法有多种，检测方法可根据需要依据推荐标准监测。十一、贯彻标准的要求和措施建议建议由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会组织本标准的宣传、推广和实施监督。十二、废止现行有关标准的建议无十三、其他应说明的事项无
