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1、碱结合臭氧预处理玉米秸秆促进纤维素酶解规律研究摘要本实验的目的是探究如何更好的破坏木质纤维素外面致密的网状结构，降低纤维素结晶的结晶度，提高纤维素的酶解率。前期大量研究致力于NaOH结合臭氧预处理后秸秆纤维素酶解效果，发现秸秆于2%Na0H溶液中在80C下处理2h结合初始Ph9下臭氧浓度78mgmL处理25min后纤维素酶解率最高。本文在最优预处理条件基础上设置处理时间梯度，分析达到最优预处理过程中木质素去除率、纤维素和半纤维素含量变化，纤维素酶解转化率；采用神经网络反向传播算法建立预处理对纤维素酶解影响的动力学数学模型。实验结果表现为在NaOH处理120min和臭氧处理25min的过程中，随
2、着木质素含量的下降和纤维素含量的上升，纤维素酶解转化率呈上升趋势，NaOH处理12Omin时木质素去除率最高为86.66%,纤维素含量最高为65.63%,此时的纤维酶解效果最好，酶解转化率达90.11%。最优碱结合臭氧预处理玉米秸秆的纤维素酶解动力学研究表明，根据所测数据推导的模型可以成功应用于预处理促进纤维素酶解转化率的设计预测中，均方根误差百分比为0.351%。关键词：臭氧；协同预处理；纤维素酶水解;木质素AbstractThepurposeofthisexperimentistoexplorehowtobetterdestroythedensenetworkstructureoflign
3、ocellulose,reducethecrystallinityofcellulosecrystals,andincreasetheenzymatichydrolysisrateofcellulose.AlargenumberofpreviousstudiesfocusedonthecelluloseenzymatichydrolysiseffectofNaOHcombinedwithozonepretreatment.Itwasfoundthatthestrawwastreatedin2%NaOHsolutionat80for2hoursandtheinitialPh9ozoneconce
4、ntrationat78mg/mLfor25minutesaftercellulasedigestion.Thehighestrate.Inthispaper,theprocessingtimegradientissetonthebasisoftheoptimalpretreatmentconditions,andtheligninremovalrate,thecelluloseandhemicellulosecontentchanges,andtheenzymatichydrolysisconversionrateofthecelluloseduringtheoptimalpretreatm
5、entprocessareanalyzed;theneuralnetworkbackpropagationalgorithmisadopted.Akineticmathematicalmodelfortheeffectofpretreatmentontheenzymatichydrolysisofcellulosewasestablished.TheexperimentalresultsshowedthatduringtheNaOHtreatmentfor120minandtheozonetreatmentfor25min,withthedecreaseoflignincontentandth
6、eincreaseofcellulosecontent,theenzymatichydrolysisconversionrateofcelluloseshowedanupwardtrend,andtheligninremovalratewasthehighestat120minafterNaOHtreatment.86.66%,thehighestcellulosecontentwas65.63%.Atthistime,thebestenzymolysisefficiencywasachieved,andtheenzymolysisconversionratewas90.11%.Cellula
7、sedigestionkineticsofoptimalalkali-bondedozonepretreatmentofcornstovershowedthatthemodelderivedfromthemeasureddatacanbesuccessfullyappliedtothedesignpredictionofpretreatmentforpromotingtheenzymatichydrolysisrateofcellulose,andtherootmeansquareerrorpercentageis0.351%.Keywords:Ozone;Combinedpretreatme
8、nt;Enzymatichydrolysisofcellulose;Lignocellulose目录1引言11.1 木质纤维素三种主要成分的定义11.1.1 纤维素11.1.2 半纤维素21.1.3 木质素21.2 木质纤维素预处理技术31.2.1 物理法预处理31.2.2 化学法预处理41.2.3 生物法预处理51.2.4 混合法预处理51.3 臭氧处理木质纤维素技术研究进展61.4 目的及意义62.材料与方法62.1 材料62.2 实验方法72.2.1 玉米秸秆中纤维素、半纤维素、木质素含量的测定72.2.2 HPLC法测定单糖及预处理降解副产物82.2.3 纤维素酶解转化率的计算：92.
9、2.4 预处理方法92.2.5 酶解方法102.2.6 预处理产物测定103结果与讨论103.1 预处理玉米秸秆质量损失率分析103.2 碱结合臭氧预处理中NaOH处理玉米秸秆质量损失率分析103.3 碱结合臭氧预处理中臭氧处理玉米秸秆质量损失率分析113.4 碱结合臭氧预处理条件对秸秆纤维素酶解转化率的影响113.4.1 碱结合臭氧预处理中NaOH处理条件对秸秆纤维素酶解转化率的影响.123.4.2 碱结合臭氧预处理中臭氧处理条件对秸秆纤维素酶解转化率的影响123.5 碱结合臭氧预处理条件对玉米秸秆纤维素含量的影响133.5.1 碱结合臭氧预处理中NaOH处理条件对玉米秸秆纤维素含量的影响1
10、33.5.2 碱结合臭氧预处理中臭氧处理条件对秸秆纤维素含量的影响143.6 碱结合臭氧预处理条件对秸秆半纤维素含量的影响153.6.1 碱结合臭氧预处理中NaOH处理条件对秸秆半纤维素含量的影响153.6.2 碱结合臭氧预处理中臭氧处理条件对秸秆半纤维素含量的影响153.7 碱结合臭氧预处理条件对秸秆脱木质素率的影响163.7.1 碱结合臭氧预处理中NaOH处理条件对秸秆脱木质素率的影响163.7.2 碱结合臭氧预处理中臭氧处理条件对秸秆脱木质木质素率的影响173.8 碱结合臭氧预处理玉米秸秆酶解动力学研究183.8.1 动力学模型的建立193.8.2 非线性拟合图203.8.3 模型的应用
11、204.结论22参考文献23致谢错误!未定义书签。1引言1.1 木质纤维素三种主要成分的定义木质纤维素是天然可再生木材经过化学处理、机械法加工得到的有机絮状纤维物质，无毒、无味、无污染、无放射性。木质纤维素主要通过光合作用等各类生物方式转化而来，是植物细胞壁的重要组成部分。其来源广、品种多，其来源主要包括树木、农作物稻杆、植被、草类等。木质纤维素是结构复杂的高分子复合物，主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，其中大部分纤维素以结晶态纤丝的形式存在，被包裹于半纤维素、木质素通过共价键连接构成的空间网状结构中。这种结构特点使得木质纤维生物质对相关的降解酶类具有较强的抗性，导致其酶水解效率低下，限制木
12、质纤维素资源的利用。1.1.1 纤维素纤维素作为生物质的重要组成部分，是由D-葡萄糖单元p-1,4-糖苜键结合而成的链状高聚体，其分子由碳（44.44%）、氢（6.17%）、氧（49.39%）三种元素构成，化学结构实验分子式为（C6Ho5）n,其中n为纤维素聚合度。在纤维素分子中，纤维素的葡萄糖单元的C2和C3位含仲醇羟基，C6含伯醇羟基，除游离羟基外，这些羟基形成了纤维素分子内或者分子间氢键，在碱性溶液中，大量低分子量纤维素会发生润胀及溶解网。部分纤维素分子链规则平行排列且定向良好，表现出晶体特性，即形成了纤维素结晶区；而部分纤维素分子链无序排列，形成了纤维素无定形区（图1）。结晶区之间的连
13、接部分为无定形区，两者无明显的界限，彼此间的过渡是渐变的。即纤维素是同质多晶的大分子化合物，是结晶区和非结晶区交错联结构成的二相体系。现已知的纤维素的结晶结构有纤维素1（天然纤维素）、纤维素11（水化纤维素）、纤维素III、纤维素IV以及纤维素V五种。纤维素I的结晶结构存在三斜晶系Ia（triclinic）和单斜晶系I（monoclinic）两种变体，前者主要存在于细菌及藻类中，后者主要存在于木材及高等植物中。纤维素通过水解可得到葡萄糖和低聚物，这些葡萄糖和低聚物可作为食品和饲料，也可作为原料进一步生产乙醇等其他物质网。纤维素也是一种相对吸湿材料，但不溶于水，由于纤维素链的亲水特性一般在水中只
14、是发生润胀，目前，常用的溶解纤维的体系主要有磷酸、氧氧化钠/尿素等。图1纤维素结构1.1.2 半纤维素半纤维素是植物纤维原料中含量仅次于纤维素的第二大类多糖，与纤维素不同，半纤维素是无定形的带有支链的不均一聚糖，由多种单糖和糖醛酸组成。组成半纤维素的单糖有D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖；糖醛酸有D-半乳糖醛酸、4-0-甲基-D-葡萄糖醛酸及D-葡萄糖醛酸。通常，半纤维素分为以下五种类型：葡萄糖甘露聚糖、半乳甘露聚糖、木聚糖（阿拉伯木聚糖和4-0-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖）、葡聚糖及木糖葡聚糖。通常，依据植物纤维原料的种类、地理位置、取材部位、处
15、理方法的不同,半纤维素结构各不相同。针叶木中半纤维素主要为半乳糖葡萄糖甘露聚糖和阿拉伯糖半乳聚糖，阔叶木中半纤维素主要为葡萄糖醛酸木聚糖和葡萄糖甘露聚糖,禾本科植物中半纤维素主要为阿拉伯木聚糖和葡萄糖醛酸木聚糖。通常，碳水化合物（主要为半纤维素）与木质素交联形成木质素-碳水化合物复合体。在禾本科原料中，半纤维素还与木质素通过半纤维素-酯键-阿魏酸-酸键-木质素的形式相连接，而通过氢键和范德华力附着在纤维素表面，因此也将半纤维素比作填充在纤维细胞壁间的“粘合剂”。与纤维素相比，半纤维素易于被水解成单糖。在木质纤维原料的主要组分中，半纤维素是对热化学最为敏感的组分口纥1.1.3 木质素木质素是植物
16、纤维原料中第三大高分子聚合物，它存在于植物细胞壁中，赋予纤维原料刚性、防渗、抗微生物攻击及氧化应激等性能UL木质素的基本单体愈创木基苯丙烷（G）、紫丁香基苯丙烷（三）及对羟基苯丙烷（三）组成了其基本结构单元。每种木质素结构单元含量的差异及结构单元间形成的连接键的多样性，使得同一种植物不同部位的木质素结构也表现出不均一性。不同种类的植物中木质素的含量及组成也具有显著的不均一性，针叶木主要由G型单元组成，木质素含量为25-35%；阔叶木由G型和S型单元组成，木质素含量为20-25%；而禾本科植物木质素由G型、S型和H型三种单元组成，木质素含量为15-25%,21o木质素结构单元间的联接方式主要为碳
17、碳键和酸键，其中，酸键联接是最主要的联接方式，大约占60%-70%,主要有二芳基酸键、二烷基醛键及烷基芳基酸键口比碳碳键的联接方式有-5-l5-5,及p，等。此外，木质素大分子具有多种功能基，如甲氧基、羟基和陵基等。其中，甲氧基是木质素最有特征的功能基，一般比较稳定；羟基是木质素重要功能基之一，对木质素的化学性质影响较大。羟基存在两种类型：一种是苯环上的酚羟基，另一种是侧链上的脂肪族羟基。1.2 木质纤维素预处理技术由于不同植被的木质纤维素中，纤维素、半纤维素、木质素含量不同，降解时采用的预处理条件也不同，例如：生物质复杂的空间结构，意味着要高效充分地利用其中的碳水化合物，必须先进行预处理，打
18、散其紧密结构。即利用物理、化学、生物过程，解除木质素对纤维素的封闭、瓦解纤维素的晶体结构、消减纤维素与木质素间的强结合键”41,提高酶的可及性，提升转化效率(图2)。目前，纤维素预处理的技术主要集中在下面几个方面。图2预处理对木质纤维素原料结构的影响1.2.1 物理法预处理物理预处理方法主要是利用机械力作用等处理木质纤维素，使其纤维素微粉碎化。物理预处理方法可以增加酶与底物接触的表面积，减少纤维素的结晶度和聚合度。(1)粉碎预处理秸秆等生物质通过粉碎可减小粒径大小，进而增加原料的比表面积，降低纤维素的结晶度和聚合度，以此来促进后续的酶解或其他的处理进程。有研究表明，球磨预处理稻草和甘蔗秸秆60
19、min后，它们的纤维素酶解率分别提高到89.4%和63.6%。然而，通过球磨获得小粒径纤维原料是一个高耗能的过程，大约要消耗掉整个工艺能耗的l3o因此，粉碎预处理往往不被单独用于生物质能源的生产过程，而是与其他预处理方法结合起来。（2）蒸汽爆破预处理蒸汽爆破也称为自水解过程，是在一定压力下，过饱和蒸汽充分浸润到秸秆的纤维组织中，加热至一定温度下反应一段时间，然后迅速减压,蒸汽快速释放，使秸秆发生爆破,严重破坏木质纤维结构，从而达到促进秸秆降解和转化的目的。这个过程常见的温度为16027（C,压力为25MPa,无化学试剂的添加，处理时间是几秒到几分钟“明但蒸汽爆破可能会促进纤维素非结晶区结晶，这
20、会降低纤维素酶对纤维素的酶解效率。（3）高温水热预处理水热预处理又称为高温液态水预处理，是一种与蒸汽爆破很相似的方法，处理温度为14022（C,当温度升高时压力将水保持在液态，该方法反应时间短，转化率高，适合草本植物、木本植物。郭晓亚126）等人的研究表明，高温水热处理玉米芯时，当温度超过160,纤维素无定型区域的链结构开始断裂，随着温度继续升高到180。（2,纤维素聚合度（DP）急剧下降，同时木质素去除率达到31.6%,结果还表明：水热预处理能够破坏纤维素糖昔键，使纤维素I转化为纤维素II。如果为了增加纤维素的接触比表面积和降解能力，则需要较高的处理温度，因此水热预处理有时能耗较大。（4）辐
21、射预处理辐射预处理是利用微波、超声波、Y射线或高速离子等高能射线对生物质原料进行一定时间处理的预处理方式,这会引发原料的物理、化学或生物学的变化，增加纤维素的反应活性。JaCkoWiak等口对麦秸和柳枝稷的微波预处理表明：微波预处理的产气效果会因生物质原料不同而有所不同。辐射预处理污染小、工艺时间短，但成本相对昂贵，这限制了其在工业化中的应用。1.2.2 化学法预处理（1）酸法预处理在有机酸或无机酸等的作用下，纤维素与半纤维素之间的糖苜键会发生断裂,产生低聚糖或单糖，从更易于后续的微生物发酵或酶解。根据酸浓度的大小，酸处理分为低温浓酸处理和高温稀酸处理。浓酸处理效果好，但腐蚀性强、危险性大。稀
22、酸处理反应速度快，且酸液不需回收，适合连续生产，但木质素多数不溶于酸，故稀酸处理对木质素作用较弱。MOnlaU等在170。C对向日葵进行质量分数为1%的硫酸处理，结果显示：预处理后甲烷产气量从195mLg增长到了289mLg1,91o(2)碱预处理碱预处理是利用碱性物质，如NaOH、Ca(OH)2H2O2或氨水等处理木质纤维生物质，断裂木质素与碳水化合物之间的交链，对连接半纤维素和其它组分的分子间酯键起到皂化作用，胀润木质纤维材料，有效地去除木质素，2,增加纤维原料的多孔性和内部的比表面积，使酶可以更有效地接触和降解纤维原料,同时一定程度上破坏木质素的结构，增强多聚糖的反应性，进而提高纤维素转
23、化率。(3)氧化预处理湿氧化法倒是通过加热、高压、碱性环境、水和氧气的共同作用处理纤维原料，降解木素和半纤维素，膨化纤维素，有利于提高水解效率或增加生物质液化适应性的预处理技术。如臭氧预处理、Fenton预处理囚】。房桂干对杨木废弃物进行湿氧化预处理，发现处理后分离液中木糖含量较高，并含有单糖降解产物如乙酸、甲酸和糠醛等，同时显示：湿氧化能较大幅度地降解或脱除原料中的木质素和半纤维素，改变原料的结晶结构,增加可酶解性,提高物料纤维素转化率。但湿氧化预处理过程中的高温高压会导致较高的投资和成本。1.2.3 生物法预处理生物预处理是生物质厌氧发酵中常见的预处理方式,利用白腐真菌、褐腐菌、软腐菌等微
24、生物菌种或木质素降解酶等对原料进行处理，断裂纤维素和木质素之间的化学键，降解原料中的木质素，破坏木质纤维生物质的结构，增加秸秆的孔隙率，进而提高秸秆的水解率124】。生物预处理相比其他预处理法，反应条件温和、能量投入低，但处理时间往往很长，而且降解木质素的微生物种类少、要求的条件苛刻。1.2.4 混合法预处理以上所提的各种预处理方法单独使用都能在一定程度上破坏木质纤维生物质的结构，但各自的缺点有时又限制了其在工业化中的发展。因此，2种或多种预处理的相互结合被认为是克服这些不足的极有前景的方法。Arantes等即利用褐腐菌和Fenton试剂相结合的预处理方式处理木材，最后发现：褐腐菌能够促进Fe
25、nKm反应降解纤维素、半纤维素，修饰木质素。Chao网利用过氧化氢协同氨纤维爆破的预处理玉米秸秆表明：协同预处理后秸秆的产糖率是未预处理秸秆的3.31倍。与单一预处理法相比，联合预处理能缓和预处理条件、提高生物质转化率，但是，相应地也增加了预处理的成本。1.3 臭氧处理木质纤维素技术研究进展臭氧是氧气的同素异形体，常温下是一种不稳定的、具有鱼腥味的淡蓝色气体，微量时具有“清新”气味。它是自然界最强的氧化剂，其氧化还原电位仅次于氟，位居第二127,能与许多有机物或官能团发生反应，如C=C,C三C、芳香化合物、杂环化合物、N=N、C=NC-Si、-OH、-SH、-NH2、-CHO等，还可与含有共扰
26、双键和高电子密度功能基团的物质发生强烈反应128】。木质素由于含有大量的C=C双键，因此会与臭氧发生一系列的化学反应降解为一些低分子量的物质，主要是有机酸，如蚁酸和乙酸，最终降解为二氧化碳和水。臭氧处理可在常温常压下进行，可有效去除木质素，方法简单，能分解氨、碱处理不能分解的双子叶类的木质纤维素。BenXo网等人用臭氧对白杨木材进行预处理，发现前解成糖的效率取决于臭氧的吸收率。PanneerSelVaml3。1等人采用单向和反流两种臭氧流量配制浓度分别为40mg/L、50mg/L、58mg/L的臭氧处理能源草，根据处理后固体中木质素含量和葡聚糖保留量对预处理条件优化，结果表明臭氧处理可以有效去
27、除木质素而不降解纤维素。BUIeM等人用臭氧处理小麦秸秆，用臭氧处理小于60目的小麦秸秆颗粒2h,结果表明木质素结构被大幅修改，相对应臭氧处理样品的糖回收率从13.11%增加到63.17%。1.4 目的及意义玉米秸秆木质化程度较低，碳水化合物含量较高并且易于收集卬】，因而在木质纤维素资源应用领域具有较高的利用价值。意义：NaoH处理能显著促进纤维素、半纤维素、木质素片段降解成低分子量的可溶性化合物阳L从而有效破坏木质纤维的结构、改变木质纤维组分的含量134】，进一步促进酶解。臭氧具有强氧化性，但其溶解性低并具有选择氧化性，因而臭氧氧化技术的气-液传质速率慢、氧化能力弱、成本高和臭氧利用率低等问
28、题，限制了其单独应用361。故采用NaOH.臭氧不同预处理条件组合处理脱脂后玉米秸秆，探讨其对纤维素酶水解效果的影响以及预处理过程中物料的化学成分、结构的变化，以期为木质纤维生物质的实际应用提供参考。2.材料与方法2.1 材料实验所用原料是来自东北四平某农场的玉米秸秆，原料经粉碎机粉碎后，过60目筛，用甲苯：乙醇二2：1进行索式抽提3h,烘干至恒重备用。采用两步酸水解法测得秸秆中纤维素含量为40.83%,半纤维素含量为21.97%,木质素含量28.15%o表2-1主要化学试剂名称级别厂家氢氧化钠北京化工厂三水合乙酸钠分析纯北京化工厂浓硫酸分析纯北京化工厂冰乙酸分析纯北京化工厂葡萄糖标准品北京化
29、工厂木糖标准品北京化工厂阿拉伯糖标准品北京化工厂半乳糖标准品北京化工厂甘露糖标准品北京化工厂纤维素酶El酶制剂Sigma公司供葡萄糖昔酶酶制剂Sigma公司半纤维素酶酶制剂Sigma公司放线菌酮TLCSigma公司四环素盐酸盐USPAmresco公司表22主要仪器设备仪器名称型号厂家粉碎机9FO-20北京燕京牧机公司二厂电子天平BS200S德国Sartorius公司PH计PB-IO德国Sartorius公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240A上海精宏实验设备有限公司立式自动电热压力蒸汽灭菌锅LDZX-40B1上海申安医疗器械厂高效液相色谱仪1200美国Agilent公司色谱柱RezexROA美
30、国phenomenex公司双光束紫外分光光度计TU-1901上海棱光技术有限公司恒温荡水浴锅HH.SY21-NY北京长风仪器仪表公司实验室臭氧发生器CF-IOF北京沃雪阳光科技有限责任公司磁力搅拌器85-2上海司乐仪器厂2.2 实验方法2.2.1 玉米秸秆中纤维素、半纤维素、木质素含量的测定采用两步酸水解法。第一步：准确称取0.3OOg待测样品放入试管中，加入3.0mL72%硫酸溶液，漩涡混合。将试管放入30。C水浴锅中保持60min,每隔510min漩涡混合一次,混合的目的是使样品与酸充分接触并完全水解。第二步:将试管从水浴锅中取出，加84mL去离子水将硫酸浓度由72%稀释到4%,继续放入灭
31、菌锅中121。C保持1h,抽滤。滤液过0.22m滤膜，HPLC法测定其中的葡萄糖和木糖含量，用于计算样品中纤维素和半纤维素含量；紫外可见分光光度法测定其中的酸可溶性木质素(acidsolublelignin,ASL)；滤渣105。C干燥至恒重后测定样品中酸不溶性木质素(acidinsolublelignin,AIL)含量，该方法测定的酸不溶性木质素中包含酸不溶性灰分和酸不溶性蛋白质，由于二者含量甚微，忽略不计。每个样品重复测定三次，以平均值作为计算的结果。酸可溶性木质素含量：滤液在32Onm下测定其吸光度，用4%硫酸作对照。用对照稀释样品，使吸光度早0.20.8之间，记录稀释度。每个样品重复测
32、定三次，以平均值作为计算结果。AL% =*1(X)(1)ASL%=*100(2)CiHPLC测得的葡萄糖浓度，mg/mL；C2HPLC测得的木糖浓度，mg/mL；V反应体系总体积，87mL；0.9葡萄糖转化为纤维的系数；0.88木糖转化为纤维的系数；m待测样品干物质含量，mg；n稀释倍数；玉米秸秆32Onm波长下的吸光系数，30L/gcm：m2砂芯漏斗及滤渣的总质量，mg；mi为砂芯漏斗的质量，mg；2.2.2 HPLC法测定单糖及预处理降解副产物参考NREIyTP-510-42621,该方法所述的单糖包括葡萄糖、木糖，可来自于玉米秸秆组分测定中两步法酸水解液、预处理水解液、纤维素酶水解液等，
33、用以计算纤维素和半纤维素的转化率。预处理降解包括糠醛和5羟甲基糠醛，用以计算预处理过程中纤维素和半纤维素的损失率(NREL,2006)oHPLC的测定条件如下：流动相：0仪器：Agilent1200色谱柱：ReZeXRe)A及相应的保护柱检测器：示差检测器进样量：20L流动相：0.005MH2SO4,0.22m滤膜过滤，脱气流速：0.6mL/min柱温:65HPLC测得各成分的保留时间分别为:葡萄糖9.812min；木糖10.314mm；半乳糖lO247min;甘露糖10.218min;阿拉伯糖10.966min;糠醛40.824min.标准曲线如下：葡萄糖标准曲线-E台E速爰寰海海y = 4
34、E-06 - 0.0436R2 = I5000001000000 1500000 200(XXX) 2500000峰面积/AQQQQQQQ 2.O.&64.2O. 1 1_|UvWE胜彩爨长木糖标准曲线y = 4E-06 - 0.0709R2 = 0.9999IOOO(XX) 200003000000峰面积/B图3HPLC单糖及降解副产物标准曲线（八）葡萄糖，（B）木糖2.2.3 纤维素酶解转化率的计算：纤维素酶解转化率）=罕微*100（3）C3酶解液中葡萄糖浓度，mg/mL：V-酶解液的体积，mL；0.90葡葡糖转化为纤维的系数：W秸秆中纤维素含量百分数；m玉米秸秆质量，mg；2.2.4 预
35、处理方法（1）碱预处理方法准确称取2.0Og干玉米秸秆于100mL离心管中，加入30mL浓度为2%的氢氧化钠溶液，待混合均匀后，放入温度为80。C水浴摇床（150rmpmin）中反应不同时间20min40min、60min80min100min120min140min160min1800mino待反应结束后冷却，经300目细胞筛过滤，回收滤液，用去离子水清洗玉米秸秆至中性（由于清洗过程中需耗费大量水资源，因此也可以先用去离子水将处理过的玉米秸秆从深褐色清洗至浅黄色，即清洗过玉米秸秆的去离子水为无色后，用0.1mol/L的稀硫酸调PH至中性），回收清洗过的玉米秸秆，然后置于55烘箱中烘干以备用。
36、（2）臭氧处理方法称取碱预处理后的玉米秸秆2.00g（不包含玉米秸秆吸收的水分）于100mL离心管中，补加去离子水至30mL,充分浸润24h后将混合液初始PH值调至9,通入浓度为78mgL的臭氧反应5min10min15min20min、25min30min35min,待反应结束后，经300目细胞筛过滤，用去离子水清洗秸秆残渣至近中性，然后置于55。C烘箱中烘干以备用。2.2.5 酶解方法将经过氢氧化钠和臭氧预处理后的玉米秸秆样品置于100mL三角瓶中，加入60mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.1mol/LpH4.8)。先加入120L放线菌酮和160L四环素盐酸，再加入40L半纤维素酶，在70水浴
37、中振荡(120rpm)酶解24h,酶解反应结束后，冷却至室温，再加入120L纤维素酶、20L-葡萄糖苜酶，在50。C下振荡条件(12OrPm)酶解72h。放线菌酮可以抑制真核生物的DNA翻译从而导致细胞生长停止甚至死亡，在加入第一种酶的同时加入放线菌酮和四环素盐酸的目的是抑制微生物的生长，避免在酶解过程中微生物生长造成PH值变化，影响酶活力。酶解后经200目细胞筛过滤，回收酶解液，测定葡萄糖含量，计算纤维素酶解转化率。2.2.6 预处理产物测定根据NREL/TP-510-42623和NREL/TP-510-42618的相关标准，本文分别采用高效液相色谱法、紫外一可见光谱法和重量分析法来测定玉米
38、秸秆中的结构性碳水化合物、酸溶木质素和酸不溶木质素的含量，分析方法参考2.2.5。3结果与讨论3.1 预处理玉米秸秆质量损失率分析单独碱处理、单独臭氧处理和碱结合臭氧预处理后的玉米秸秆过3000目滤布，用去离子水洗涤，然后在50。C烘箱中烘干，称重，测定其质量损失率进行比较分析：质量损失率=幽驾号瓷翼丝*100%理前总重量(4)3.2 碱结合臭氧预处理中NaOH处理玉米秸秆质量损失率分析如图4所示，通过实验发现随着碱处理时间的增加，玉米秸秆的质量损失率呈先快速上升后缓慢上升的趋势，说明碱处理时间越长对木质素的去除越多，损失部分可能包含少量半纤维素和纤维素，但是具体损失和影响需进一步研究；碱处理
39、不同时间后都进行相同的臭氧处理，发现其质量损失率均高于单独的碱处理,说明碱结合臭氧预处理效果优于单独碱处理；并且结合预处理后玉米秸秆质量损失率呈先急剧上升后下降的趋势，在碱处理12Omin结合臭氧处理时达到质量损失率最大，说明碱处理120min结合臭氧处理对玉米秸秆的作用效果最好，而且随处理时间延长，处理效果越来越差。(%) mso 一 咨 n55图4碱结合臭氧预处理中NaOH处理对秸秆质量损失率的影响3.3 碱结合臭氧预处理中臭氧处理玉米秸秆质量损失率分析臭氧处理不同时间与碱处理120min结合臭氧处理不同时间对玉米秸秆质量损失的影响如图5所示，通过实验发现随着臭氧处理时间的增加，玉米秸秆的
40、质量损失率呈缓慢上升的趋势，说明臭氧处理时间越长对玉米秸秆的作用效果越好,但是整体效果不明显；碱处理120min后臭氧处理不同时间，发现其质量损失率远远高于单独臭氧处理的不同时间，说明碱结合臭氧预处理效果优于单独臭氧处理，并且碱结合臭氧预处理后玉米秸秆质量损失率随臭氧处理时间呈非常缓慢上升后缓慢下降的趋势，在碱处理12Omin结合臭氧处理25min时质量损失率达到最大，说明碱处理120min结合臭氧处理25min对玉米秸秆的作用效果最好，而且随臭氧处理时间的延长，可能产生一定的降解副产物对处理效果有抑制作用，导致质量损失率下降。() 右三1*0一 SSpN图5碱结合臭氧预处理中臭氧处理对秸秆质
41、量损失率的影响3.4 碱结合臭氧预处理条件对秸秆纤维素酶解转化率的影响3.4.1 碱结合臭氧预处理中NaOH处理条件对秸秆纤维素酶解转化率的影响碱处理不同时间对纤维素酶解率作用的影响见图6,从图中可以看出，随单独碱处理时间的增长，纤维素的酶解转化率呈先升高后略微降低，当碱处理120min时，纤维素的酶解转化率达到最高值67.73%；碱处理不同时间后臭氧处理相同时间的纤维素酶解转化率均高于单独碱处理不同时间，碱处理润涨纤维素后,臭氧分子进入木质纤维素内部破坏和去除阻碍纤维素与酶接触的障碍，因此结合处理的效果比单独处理的效果好。随着结合处理时间的增加，纤维素酶解转化率呈现先升高后略微降低的趋势，在
42、碱处理120min结合臭氧处理25min时，纤维素酶解转化率达到最高90.11%。在0-12Omin处理过程中，单独碱处理的纤维素酶解转化率上升迅速，碱处理结合臭氧处理的纤维素酶解率上升缓慢，说明碱处理使秸秆中的纤维素充分润涨，之后臭氧处理在去除非纤维素部分的同时带走了部分无定型纤维素，因此纤维素酶解率上升缓慢，但是随解率较高。碱处理时问过长时，酶解转化率略微的降低，可能是较长时间的碱处理使微晶纤维素微纤丝之间强烈的聚合力及其他一些作用力导致纤丝团簇在一起，不利于酶解时纤维素和酶的充分接触。() SMoPAUOQeEAZU SMolo图6碱结合臭氧预处理中碱处理对玉米秸秆纤维素酶解转化率的影响
43、342碱结合臭氧预处理中臭氧处理条件对秸秆纤维素酶解转化率的影响臭氧处理不同时间对秸秆纤维素酶解率的影响如图7所示，随着单独臭氧处理时间的增加，纤维素的酶解转化率呈现缓慢升高趋势，在0-25min处理过程中，碱结合臭氧处理的纤维素酶解转化率的升高趋势与单独臭氧处理的相似，都是缓慢上升，但纤维素酶解转化率均远远高于单独臭氧处理的，说明木质纤维素表面的杂质及其内部的复杂结构阻碍了臭氧分子深入，所以对木质纤维素结构的破坏作用较小，因此，单独的臭氧处理并不能有效的纤维素降解。由上一部分得知，单独碱处理120min的纤维素酶解转化率为67.73%,碱处理120min后臭氧处理发现,纤维素酶解转化率均大幅
44、增加,在臭氧处理25min时达到最高90.11%,说明此条件下充分去除了影响纤维素与酶接触的阻碍；而继续处理时纤维素酶解转化率略微下降，原因可能是纤维素长期暴露在臭氧的环境中，部分纤维素被臭氧氧化降解。() S-SAPAU HAZU a SMo-o图7碱结合臭氧预处理中臭氧处理对玉米秸秆纤维素酶解转化率的影响3.5 碱结合臭氧预处理条件对玉米秸秆纤维素含量的影响3.5.1 碱结合臭氧预处理中NaOH处理条件对玉米秸秆纤维素含量的影响2%NaOH处理不同时间与2%NaOH处理不同时间协同臭氧pH9处理25min对秸秆中纤维素含量的影响见图8,由图可见，单独碱处理20-6Omin时纤维素含量缓慢增
45、加，60-12Omin时纤维素含量增加迅速，处理12Omin后，纤维素含量逐渐降低，在80下单独碱处理120min时纤维素含量最大为62.98%；碱处理不同时间后臭氧处理相同时间，随处理时间的增加，纤维素含量变化趋势与单独碱处理的相似,但是纤维素含量均高于单独处理不同时间，碱处理120min结合臭氧处理25min时达到最大纤维素含量65.63%,与出现最大酶解率时的处理条件相同，说明此条件下NaOH处理不光能去除表面的非纤维素成分，还能够更充分润胀秸秆中的纤维素，因而相对应的纤维素含量均显著增加，因而纤维素酶解率显著上升。但是随着处理时间继续增加，纤维素含量急速下降，可能在此过程中去除秸秆中非
46、纤维素类成分的同时还去除了秸秆中部分无定形纤维素。70-1-一ATaATdifferenttimewithOT25minO20406080100120140160180Time(min)图8碱结合臭氧预处理中NaOH处理对玉米桔秆纤维素含量的影响3.5.2 碱结合臭氧预处理中臭氧处理条件对秸秆纤维素含量的影响单独臭氧处理不同时间与碱处理120min结合臭氧处理不同时间对玉米秸秆中纤维素含量的影响见图9,从图中可以看出，纤维素含量随着单独臭氧处理时间的增加而增加，但是增加缓慢，35min时达到35.59%,说明臭氧处理可以增加纤维素的暴露，纤维素酶解转化率的变化趋势与纤维素的变化趋势一致；碱处理
47、相同时间后臭氧处理不同时间时纤维素含量均比单独臭氧处理的高，而且随处理时间的增加呈现先增加后降低的趋势，在碱处理120min结合臭氧处理25min时纤维素含量达到最大65.63%,结果与8碱处理不同时间结合臭氧处理25min相同，说明碱处理在去除秸秆表面杂质的同时使纤维素得到充分润涨，这样臭氧分子可以进入秸秆内部打开复杂的网络结构，使得纤维素含量增加，继续处理纤维素含量下降，可能是臭氧分子长期与纤维素接触，一些容易被降解的纤维素结构可能被去除，因而纤维素含量降低，相应的纤维素酶解率也下降，说明在80C下碱处理12Omin结合臭氧处理不同时间，纤维素含量的变化是影响酶解的重要因素。()c2uou s_SAo=vu图9碱结合臭氧预处理中臭氧处理对玉米秸秆纤维素含量的影响3.6 碱结合臭氧预处理条件对秸秆半纤维素含量的影响3.6.1 碱结合臭氧预处理中NaOH处理条件对秸秆半纤维素含量的影响碱处理不同时间对秸秆中半纤维素含量的影响见图10,从图中可以看出，单
