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1、内切葡聚糖酶基因在巨大芽抱杆菌中重组表达载体的构建四川生物科学2003级廖俊华指导教师陈惠教授摘要：以生物化学与分子生物学实验室克隆并测序的枯草芽花杆菌C-36内切葡聚糖酶基因(Genbank登录号：DQ782954)为模板，通过PCR将编码信号肽的序列去除，然后与PMDI8TVeCtOr克隆载体连接，构建PMDI8-TVector亚克隆载体。对PMDI8-TVector质粒先进行a711单酶切，回收后再进行&7I单酶切，通过两次单酶切胶回收内切葡聚糖酶基因(不含信号肽)，并构建巨大芽花杆菌重组表达载体PHEC-End,将重组表达载体转化到大肠杆菌DH5中。通过对转化子进行菌落PCR与质粒的酶
2、切检测证明成功构建了内切葡聚糖酶的巨大芽袍杆菌表达载体。关键词：巨大芽抱杆菌，枯草芽抱杆菌，内切葡聚糖酶,重组表达载体ConstructionofeukaryoticExpressionVectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumLIAOJun-huaBiologicalScience,Grade2(X)3DirectedbyChenHui(Prof)Abstract:BythewayofPCR,thesequencecomingfromendoglucanasegene(GenbankNo.DQ782954)inB.subtilisC-
3、36strainandcodingforthesignalpeptideofendoglucanasewasremoved.TheendoglucanasegenewasclonedandsequencedintheLaboratoryofBiochemistryandMolecularBiology.ThenthegenewithoutthesignalpeptidesequencewasligatedwiththecloneplasmidpMD18-T.ThepMD18-TVectorwasconstructed.First,thepasmidwascutedbyBgl.Then,thep
4、asmidwascutedbySphI.Bydoubleenzyme-cut,thegeneofendoglucanaseinB.subtilisC-36strainwithoutsignalpeptidewasrecived.TheeukaryoticexpressionvectorpHEC-Endwasconstructed.Eventually,theeukaryoticexpressionvectorwastransformedintocompetentE.coliDH5.BythewayofcolonyPCRandrestrictionenzymedigestinganalysis,
5、theeukaryoticexpressionvectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumwasconstructedsuccesfully.Keywords:BacillusMegaterium,Bacillussubtilis,endoglucanase,eukaryoticexpressionvector纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不一致能够分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶与B-葡萄糖甘酶三大类。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，关于人类社会解决食物短缺与能
6、源危机具有重大的现实意义。随着中性纤维素酶与碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能与巨大的经济价值。纤维素酶成本高与酶活力低已成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此，构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。几乎所有已克隆到的纤维素酶基因都在大肠杆菌中得到了表达，但是都几乎存在着表达量低、分离提纯困难的缺陷。而芽泡杆菌因具有特殊的蛋白分泌系统，使得在表达外源蛋白的宿主菌中深受青睐。其中枯草芽胞杆菌是应用较广泛的一种外源蛋白表达系统，同时已用于商业化生产酶制剂，比如，Genecor厂家就以该菌作为生产碱性蛋白酶的工
7、程菌。近年来，巨大芽狗杆菌也在这方面显示出了较好的应用前景，与枯草芽狗杆菌相比，巨大芽泡杆菌还具有两大优点：首先是它不具有碱性蛋白酶，从而使外源蛋白能很好的表达而不被降解；再次是重组质粒能够在宿主菌中稳固存在。有很多蛋白已经成功地在巨大芽狗杆菌中得到过量表达，如：RygUS与HiIICn(1991)在巨大芽抱杆菌中成功地表达了四种外源蛋白基因，在木糖操作子的调控下，这些基因的表达提高130到350倍不等,且未发现蛋白酶水解情况。目前还未见有关在巨大芽袍杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道，四川农业大学生物化学实验室通过自行筛选得到一株产内切葡聚糖酶的枯草芽泡杆菌并克隆到了编码该酶的基因(Genbank
8、No.DQ782954),拟在此基础上构建该基因的巨大芽泡杆菌表达载体，实现该基因在巨大芽胞杆菌中的分泌表达。本实验将不含信号肽枯草芽胞杆菌C-36内切葡聚糖酶基因与巨大芽胞杆菌表达载体PHIS1525进行连接，构建重组表达载体，使之能在表达载体自身信号肽的引导下进行融合表达，为进一步研窕枯草芽范杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在巨大芽狗杆菌中的高效表达及基因工程菌投入生产奠定基础。1材料与方法1.1 菌株及载体：本工作所使用的菌株与质粒见表Io表1实验所用的菌株及质粒Tab1ThestrainandplasmidusedintheexperimentSlrainZplasmidCharacter
9、isticssourceJM109recA1supE44endA1hsdR17gyrA96relAlthi(lac-proAB)FStoredinthislabDH5supE44lacU169(801acZM15)recAlStoredinthislabpMD18-TVectorAmprIacZTaKaRaBiotechnologypHIS1525TetrAmprxylRPxylAMoBiTecB3plasmidpMD18-TVectorincludingtheendoglucanasegeneConstructedinthislab1.2 分子生物学试剂:引物由上海英俊生物技术有限公司合成；
10、BglVl、SphIy重组TaqDNAPolymerasedNTPT4DNALigasepMD18-TVeCtor购自TaKaRaBiotechnology；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNAMarkerIIKDNAMarkerVIKDNAHindIn购自天为时代;氨茉青霉素购自上海生工。1. 3要紧药品NaCk胰蛋白陈、酵母浸出粉、琼脂粉、琼脂糖、0.lmolLCaCl2、甘油（终浓度为30%）o1.4 要紧仪器：电热恒温培养箱、HZQ-F全温振荡培养箱、酸碱PH计、TGLT6G台式普通离心机、板式电泳槽、电热恒温水浴锅、PCR仪、凝胶成像仪等。1.5 培养基、抗生素贮存液及琼脂糖电泳缓
11、冲液：LB培养基：1%胰蛋白陈，1%NaCb0.5%酵母浸出粉，pH7.0（用lmolL的NaOH调PH值）；配制固体培养基时需加入1.5%-2.0%的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入氨苇青霉素（终浓度为IOoUgmL）。氨茉青霉素（AnIP）贮存液：100口8/疝（溶于双蒸水中），过滤除菌，小份分装（ImL/份）后，-20C储存。琼脂糖电泳缓冲液叫5XTBE贮存液:54gTris碱，27.5g硼酸,20mL0.5molLEDTA(pH8.0),溶于IL去离子水，用时稀释10倍。0.5molLEDTA(pH8.0)：将186.Ig二水乙二胺四乙酸(EDTA-Na.2乩0)加入80OmL水中，用
12、磁力搅拌器剧烈搅拌，用NaOH调节PH至8.0,定容至IL0.7%的琼脂糖凝胶：称取0.7g琼脂糖于IoomLO.5XTBE中，用微波炉加热置溶液澄清为止，然后加入5HL的GOldVieW核酸染料，混匀即可用。1.6方法.1.6.1引物的设计：根据已经克隆并测序的内切葡聚糖酶基因(Genbank登录号：DQ782954),结合信号肽预测结果，应用PrimerPremier5.0软件设计一对引物，使其通过PCR去掉该基因自身信号肽编码序列，同时加入适当的酶切位点(BgIU、SPh1),使其能够通过连接将该基因置于表达载体信号肽编码序列之后(表达载体PHlSl525的多克隆位点序列如图1),且保证
13、正确的阅读框。已经预测的枯草芽狗杆菌C-36内切葡聚糖酶蛋白序列信号肽切割位点在29位与30位氨基酸残基之间，成熟蛋白为470氨基酸多肽，因此设计引物如下：上游引物(Pi)：5,Agatctcagcagagacaaaaacgccagt3下游引物(P2)：5,Gcatgcctaatttggttctgttccccaa3下划线是引入的酶切位点，分别是知II、Sph,A是为了不改变阅读框而引入的碱基。STARTMs%BsrGIArcTACAffiAAAAA(JTMTrAT(；GCATTCvnvnTGEATCG(TGATT(工Vr(KnTn(JCaxTC(KCT(1(XXX;CANarItSfoISma
14、I.KpnI,KaSLBbClBSDElXmalAcc65ISDhlCC(A门GAAGAInCCGGA(JClCCCCKiCiAICC,IACCCiCKX(；(AH；(CGGCCTnAGAGGAroGCArCACCAIrACCArCBglEcoICRI,BamHIEagINgOMiy6xHisBanlLSacINaeIMCSAeeIAmAeCGGTCCAAGAArStop图1pHIS1525的多克隆位点序列FiglSequenceofthemultiplecloningsites(MCS)ofpHIS15251. 6.2目的基因的获得：1.6. 2.1B3质粒的提取及其PCR接种一环B3菌株于
15、IomLLB液体培养基中，37C200rmin培养过夜，用质粒提取试剂盒按操作说明提取B3质粒。以提取的B3质粒为模板根据设计合成的引物进行PCRU。，通过PCR获得目的基因，其反应体系如表2：表2PCR反应体系Table2CompositionofPCR试剂名称用量ddH2O32.5L10PCRbuffer5.oL25mmolLMgCl22.0LPl1.0LP21.0LdNTPmixture6.OL模板DNA2.OLTaq聚合酶0.5LTotalvolume50.OUL按上述顺序加入各组分后混合均匀，PCR反应参数为：94预变性2min,94C变性Imin,65退火Imin,72C延伸90s
16、,30个循环后，72再延伸IOmin,4C储存。反应结束后取3MPCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。1.6.2. 2PCR产物的纯化由于克隆需要的DNA片段需要较高的纯度，PCR产物需通过琼脂糖凝胶电泳充分分离后，利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒从凝胶中回收目的DNA片段UL1. 6.3目的基因的克隆：1.6. 3.1大肠杆菌JMIo9（或者DH5a）感受态细胞的制备：参照分子克隆试验指南（第三版），使用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，具体方法如下： 挑取一环JMlO9（或者DH5）菌株在LB平板上划线37培养后，挑取单菌落转到IOmLLB液体培养基中，37C200rmin培养过夜；
17、将上述培养液按2%接种量接种到50mLLB液体培养基中37oC200rmin振荡培养2-3小时;将培养后的菌液置冰浴中Iomin后转移到无菌的50mL离心管中，4C4000rmin离心IOmin,去掉上清液，将管倒置Imin使痕量培养液流尽；向管中加入20mL无菌的预冷的0.Imol/LCaCI2溶液重新悬浮菌体，4C4000rmin离心10min,去掉上清液；向管中加入2mL无菌的预冷的0.Imol/LeaCl2溶液重新悬浮菌体；刚做的感受态细胞可直接用于转化试验，也可将剩余的感受态细胞加入终浓度为30%的甘油分装于1.5mL离心管（IooL管）置-70储存。1.6.3.2连接与转化1.6.
18、3.2.1连接：（连接体系如表3）表3目的基因与pMD18-TVector克隆载体的连接体系Table3Theligationsysterm试剂名称用量胶回收PCR产物5LpMD18-TVector1LLigationMix4L10TotalvolumeL将该反应管置PCR仪16C保温3ho1.6.3.2.2转化：（转化方法”引如下所述）取装有100LQcoJM109感受态细胞的1.5mL离心管一支,置冰浴中解冻；将上述连接好的连接液全部加入到上述离心管中，并用加样器轻轻混合均匀；将离心管放置冰浴中静置30min;30min后将离心管放置42C恒温水浴中静置2min；迅速将离心管置冰浴中静置5
19、min；向离心管中加入890LLB液体培养基置37培养箱培养90min,使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；取培养后的菌液200L用玻棒涂布在含有100gmL氨年青霉素的LB平板上，将平板置37C直至液体被汲取后将平板倒置继续培养12-16h后可出现菌落。1.6.3.3阳性克隆菌株的筛选及鉴定将涂布在抗性平板上长出的菌落，挑取大小适中的单菌落进行菌落PCR鉴定，反应体系如表2。按表2所述体系先加入各组分液体后混匀，再分装在0.2mLPCR管中，每管装25L,最后用牙签挑取适量的单菌落作为模板，PCR反应参数为同1.6.2.1所述，有一点不一致就是：94C预变性需5mirio反应结束后
20、取3LPCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，能够扩增出与目的基因大小一致的DNA片段初步认为是阳性克隆菌株。阳性克隆菌株的鉴定：将初步筛选得到的阳性菌株分别接种IOmLLB液体培养基37C200rmin培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒进行酶切鉴定，酶切体系如表4与表50表4单酶切表5双酶切Table4SingleEnzyme-cutmethodTable5DoubleEnzyme-cutmethod试剂名称用量试剂名称用量10Hbuffer1.0L10Hbuffer1.0L质粒DNA4.0L质粒DNA4.0LBglII/SphI0.5LBglII、SphI各0.5LddH2O4.5Ldd
21、O4.OULTotalvolumeio.oLTotalvolume10.OPL将上述反应体系置37恒温培养箱酶切过夜,反应完后向各体系中加IMLlOXloadingbuffer,将其全部点样到0.7%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。将酶切鉴定符合要求的菌株随机取一个（命名为KMQZ3）送TaKaRa宝生物公司测序。1.6.4表达载体的扩增由于购买的表达载体是以纯质粒的形式提供，需要将其转入大肠杆菌内进行扩增。故先进行表达载体的常规转化，再从大肠杆菌中提取质粒进行后续试验操作。将购买的表达载体PHISI525（10g）用适量的水（约20叱）溶解后，取INL转化大肠杆菌DH5感受态细胞（感受态细胞的制
22、备与转化方法与coJM109相同），在含有100gmL氨茉青霉素的LB培养基上筛选阳性转化子，并通过提取质粒与酶切进行鉴定，将阳性转化子命名为DH5-pHIS1525o1. 6.5重组表达载体的构建1.6. 5.1内切葡聚糖酶基因（己经去掉信号肽编码序列）的准备挑取一环JMIo9（含目的基因）在含氨茉青霉素的LB平板上划线培养过夜，然后挑取单菌落接种IOmL含相应抗生素的LB液体培养基，37C剧烈振荡培养12T4h后，按质粒提取试剂盒说明进行质粒的提取，提取完后进行琼脂糖凝胶电泳检测提取质量与大致浓度。先将质粒进行函单酶切，后进行如力I单酶切，两者酶切体系与方法一致。酶切完后向两管中加入5.5
23、L10Xloadingbuffer,最后将两次单酶切的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，然后从凝胶中回收所需要的目的条带，其方法与PCR产物的琼脂糖凝胶回收相同，并取5L电泳检测其回收的大致浓度。1.7. 5.2表达载体的准备挑取一环大肠杆菌DH5（含表达载体质粒）在含氨苦青霉素的LB平板上划线培养过夜，然后挑取单菌落接种IOmL含相应抗生素的LB液体培养基，37C剧烈振荡培养12-Mh后，按质粒提取试剂盒操作进行质粒的提取，提取完后进行琼脂糖凝胶电泳检测提取质量与大致浓度。将提取的质粒进行BglIl与如方I双酶切。同样，为了保证酶切后回收的DNA浓度,需做3管该反应体系。将上述反应体系置37恒温
24、培养箱酶切过夜，酶切完后向管中加入5.5L10loadingbuffer混合均匀，取5L进行电泳检测酶切情况，将其余反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后从凝胶中回收所需要的目的条带，其方法与PCR产物的琼脂糖凝胶回收相同，并取5L电泳检测其回收的大致浓度。1.8. 5.3连接及转化将已经准备好的内切葡聚糖酶基因与表达载体按表6加入进行连接反应：表6连接体系Table6Theligationsystem表达载体体L目的基因LT4DNAIigaSeL连接bufferL超纯水/ML总体系L3523215-将上述两个连接体系置PCR仪中16连接过夜，转化时分别取10L连接液分别转化大肠杆菌DH5Q感受态细胞
25、并涂布在含有100gmL氨节青霉素的LB平板上，待菌落长出后，进行菌落PCR、酶切鉴定BJ6。2结果与分析2.1目的基因的获得以提取的B3质粒为模板根据设计合成的引物进行PCR,获得的PCR产物为不含目的基因信号肽序列的片断，其大小约为1.5Kb,对获得的PCR产物取3L进行电泳，结果见图2。结果说明PCR产物大小与目的基因大小(1500bp)接近。然后对产物进行胶回收，以去掉PCR体系中的引物、模板DNA、酶等杂质，使其纯度满足随后连接要求，回收后取5L进行电泳，结果见图2。4500bp.3000bp-200ObL1200bD- 800bp 500bp200bp1.DNAMarkerIII2
26、.PCR产物3.PCR产物胶回收图2PCR扩增产物结果及产物胶回收Fig2TheresultsofPCRandgelreclaim2.2目的基因的克隆将胶回收后的目的基因与克隆载体PMDI8-TVeCtOr进行连接后转化瓦CJMlO9感受态细胞，长出菌落后挑取大小均一的菌落进行菌落PCR检测阳性转化子，菌落PCR结果如图3所示。2345617891.DNAMarker III; 2-9.为菌落PCR图3 E COIi JMlo9转化子的菌落PCR检测F3IdentificationofrecombinantExoliJM109bycolonyPCR从电泳结果能够看出，在挑取的9个转化子中，有8
27、个转化子通过其菌落PCR后得到与目的基因的大小相一致的产物，只有9号转化子未得到PCR产物，说明它是一个假阳性。根据以上菌落PCR结果，在2-8号转化子中随机挑取一个单菌落（命为KMQZ3）接种IOnILLB液体培养基（含100gInL氨苇青霉素）37剧烈振荡培养12T6h后按质粒提取试剂盒操作提取质粒，分别取3L与5L进行单双酶切鉴定，结果如图4。123451.DNAMarkerIII2. KMQZ3质粒Bgln单酶切3. KMQZ3质粒SPhI单酶切4. KMQZ3质粒BglII、SphI双酶切5. 未经酶切的KMQZ3质粒图4反COliJM109转化子的酶切检测Fig4Identific
28、ationofE.coliJM109recombinantbyrestrictionanalysis电泳结果说明：通过双酶切后能够得到与目的基因大小一致的条带，但转化子质粒杂力I单酶切后发现了两条条带，与该质粒的双酶切结果一致，通过分析发现其原因是：PCR产物与克隆载体PMDI8-TVeCtor在连接时没有按目的基因的正向顺序进行连接，刚好相反，目的基因反向连接在了克隆载体上，但这不影响本试验的后续试验，酶切结果说明目的基因已经连接到了克隆载体PMDI8-TVectoro2.3表达载体的扩增购买的表达载体是以冻干的质粒形式提供，按操作手册说明需要将其转入大肠杆菌内进行常规的扩增后再提取质粒进行
29、重组操作，故先进行表达载体的常规转化。将购买的表达载体质粒PHISI525（约10g）用适量的水（约20L）溶解后，取WL转化大肠杆菌DH5感受态细胞（感受态细胞的制备与转化与JMl09相同），涂布在含有100gmL氨茉青霉素的LB培养基上，待长出转化子后（约24h）,挑取大小均一的单菌落接种IOmLLB液体培养基，37C剧烈振荡培养12T6h后按质粒提取试剂盒操作提取质粒，再分别取3L与5L进行未酶切与单酶切的鉴定，电泳结果见图5。12 3 4 5564bp-125bp-23130bo9416bp：6557bo-4316bp, 2322bD2027bp1.ADNAZHindIII Marke
30、r2.表达载体质粒PHlSI 5253. pHIS1525 BgIn 单酶切4. pHIS1525 SCal单酶切5. pHIS1525 Sph I 单酶切图5表达质粒PHlSI525的酶切检测Fig5RestrictionanalysisoftheplasmidpHIS1525电泳结果说明，未经酶切的PHISI525质粒其分子量比实际分子量（约7.4Kb）大，但单酶切后分子量符合实际大小，其可能原因是质粒在复制过程中形成了质粒多聚体，单酶切后未发现非特异性切割，说明该质粒是PHISI525质粒。同时将该转化子命为DH5-pHIS1525o2.4重组表达载体的构建2.4.1内切葡聚糖酶基因（已
31、经去掉信号肽编码序列）的准备通过转化子的菌落PCR与酶切检测后，发现目的基因（已经去掉信号肽编码序列）反向连接在PMDI8-TVeCtOr克隆载体上，为保证随后的酶切与表达载体的正确连接，提取转化子质粒后先进行偌/II单酶切，回收后再进行甑力I单酶切，这样通过两次单酶切后保证了目的基因两端分别是由密/II、加酶切后产生的粘性末端，通过两次单酶切后用胶回收试剂盒回收目的条带，取5M电泳检测其大致浓度，结果见图6。12341 .DNAMarkerVII；2.目的基因3 .质粒PHISl525BjdH、SphI双B8切回收;4 .DNA/HindIII图6胶回收的目的基因与表达质粒PHISI525F
32、ig6ReclaimedtargetgeneandplasmidpHIS15252.4.2表达载体的准备含表达载体质粒PHlSl525的大肠杆菌DH5在含氨茉青霉素的LB平板上划线培养过夜，然后挑取单菌落接种IOmL含相应抗生素的LB液体培养基，37C剧烈振荡培养12T4h后，按质粒提取试剂盒操作进行质粒PHlSI525的提取，并对质粒进行纭/11、双酶切，电泳后切取目的条带进行胶回收，并取5L电泳检测其大致浓度，结果见图6。2. 4.3转化子的筛选及检测用T4DNA连接酶连接胶回收的目的基因（即去掉信号肽编码序列的内且葡聚糖酶基因）与表达质粒PHlSI525,将连接体系置PCR仪中16连接过
33、夜，取10叱连接液转化大肠杆菌DH5感受态细胞并涂布在含有100gmL氨茉青霉素的LB平板上，待菌落长出后，挑取菌落大小均一的单菌落进行菌落PCR,结果见图7。菌落PCR结果说明，转化子3、5、6、7均能得到与目的基因大小相一致的条带。根据电泳结果随机挑取其中的一个单菌落培养后提质粒进行酶切检测，结果见图8。123 4 5 6 7 8 91.DNA Karker VII1 2-9.懿FCR ,1.质苞 PHISI5252. A DHAZHindIII Marker3.质粒PKlSI525 Bgln单酶切4.质粒PHISl525 Sph I单酶切5.质粒PHISl525Bgl II、SphI 双
34、酶切6. Mareker VII图7 coli DH5 转化子菌落PCR图8转化子质粒醵切结果Fig7RccombinantE.coliDH5colonyPCRFig8Restrictionanalysisofrecombinant结果说明，质粒通过单酶切后没有出现非特异性条带，双酶切后可得到与目的基因大小相一致的条带，说明目的基因包含的该质粒中。通过对转化子进行菌落PCR及其质粒酶切检测，说明重组质粒已经转进了大肠杆菌DH5中。将该菌命为PHEC-End。3讨论2.1 芽布杆菌作为表达体系的优点芽袍杆菌为革兰氏阳性细菌，细胞壁不含内毒素，能分泌大量的蛋白到体外，能形成芽袍，是一些重要工业酶制
35、剂的生产菌。自1958年SPiZiZen发现枯草杆菌168菌株能摄取外源基因以后，随着DNA重组技术的发明，特别是金黄色葡萄球菌(SSWOaCCUSaureus)带抗性标志的质粒可作为其载体的发现，芽泡杆菌基因工程的工作迅速进展。作为很有吸引力的外源基因表达的宿主，芽狗杆菌有下列一些优点：除炭疽杆菌(BaC/usa7fracs)与蜡样芽抱杆菌(6ac/USCereUS)等外，多数芽抱杆菌对人畜无害，不像大肠杆菌那样具有热源性脂多糖。遗传学现在相当先进，很多噬菌体与质粒适合于用作克隆载体。具有蛋白分泌能力强的特性。当分泌蛋白跨过细胞膜后，就被加工与直接释放到培养基中，这使得回收与纯化目的蛋白较为
36、简单。良好的发酵基础与生产技术。芽胞杆菌在工业上长期被用于生产蛋白酶、a-淀粉酶与苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等。在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。细胞的生长特性与生理学性质都被广泛、深入研究。通过几十年的努力，芽抱杆菌表达系统的优越性得到发挥，许多原核与真核基因被克隆与表达，其中有的己应用于工业生产，取得了很多成绩。但是，用芽抱杆菌作为产品生产菌也暴露出一些问题：蛋白酶对目的蛋白的降解，质粒的不稳固，真核蛋白分泌表达量低或者不能分泌表达等。3. 2信号肽对外源基因表达的影响信号肽对外源基因分泌表达至关重要，同一种蛋白酶在不一致信号肽的作用下，即使都能分泌表达，其分泌效率也会相差甚远。Yan
37、gYang1网等人研究说明：当使用巨大芽抱杆菌的胞外脂酶的信号肽代替自身的信号肽时，可提高青霉素酰胺酶G表达量L7倍；Nagarajanl选择了枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、芽泡杆菌RNA酶与果聚糖蔗糖酶等四种酶的信号肽，以芽把杆菌BE1510为宿主菌，分别研究它们对重组链霉抗生素蛋白分泌效果的影响。结果说明，携带四种融合基因的菌株都能有效分泌四聚体链霉抗生素蛋白，但以用中性蛋白酶信号肽时效率最高。大肠杆菌由于细胞壁结构与芽胞杆菌不一致，很少能将外源蛋白分泌在胞外，大多在胞内形成包含体的形式。在大肠杆菌中大概信号肽的存在对外源基因的表达存在不利，如李相前等3通过PCR方法分别克隆Ccl12B完整
38、基因与不带信号肽基因至PET20b载体，构建重组质粒PET-20b-Cell2B与PET20bCell2BTS,转化至大肠杆菌JMlO9DE3诱导表达后，分析酶活，结果说明去除信号肽重组菌单位酶活是未去除信号肽重组菌的11倍多。3.3引物的设计RygUST2LYangYangl22均报道说明，外源基因在表达载体的信号肽引导比基因自身信号肽引导下具有较高的表达水平。Yang发现来自ThCnnobifidafusca的水解酶只有其密码子适合巨大芽狗杆菌时才能成功的表达，黄玉杰等人在巨大芽抱杆菌中克隆到了编码内切酶的基因，该基因片段同己发表的枯草芽泡杆菌glyBaprE之间的同源性为35%；同芽袍杆
39、菌BP23celB,短小芽抱杆菌内切葡聚糖酶与多粘芽抱杆菌B-1,4-内切葡聚糖酶的编码基因的同源性只有27%。说明巨大芽抱杆菌在密码偏爱性上与其他芽抱杆菌存在着差别。因此，在设计引物时，通过分析巨大芽胞杆菌与编码该基因的密码子使用频率，引入碱基A。使编码的内切葡聚糖酶能够正确的与表达载体PHISl525上的信号肽融合而不至改变阅读框。在本实验中，我们通过PCR去除枯草芽胞杆菌C-36内切葡聚糖酶基因中编码信号肽的序列。4结论本实验成功去除枯草芽胞杆菌C-36内切葡聚糖酶基因中编码信号肽的序列，同时将去除信号肽的枯草芽胞杆菌C-36内切葡聚糖酶基因与巨大芽胞杆菌表达载体pHIS1525进行连接
40、，成功构建了重组表达载体。参考文献1谢占玲，吴润.纤维素酶的研究进展.草业科学J,2004,21(4):72-75.2徐昶，龙敏南，鸵小兵等.高产纤维索酶菌株的筛选及产酶条件研究J.厦门大学学报(自然科学报),2005,44(1)：107-11131沈学亮，夏黎明.产纤维素酶细菌的筛选及醐学特性研究J林产化学与工业，2002,22(1)：47-514李育阳.基因表达技术M.北京，科学出版社,2002：26-295 VaryPS.PrimetimeforBacillusmegateriumJ.Microbiology,1994,140:1001-10136 RygusT,HillenW.Indu
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46、9423黄玉杰，杨合同，丁爱云等.巨大芽抱杆菌内切葡聚糖酶编码基因的克隆及序列分析J中国生物防治,2004,20(4):256-259致谢本文是在导师陈惠教授，与生物化学实验室师兄们精心指导下完成的。在学习与研究等方面他们都给予了悉心的指导与关怀，培养了我较强的实验动手能力与思考能力。他们严谨求实的态度与孜孜不倦的精神感染了我，激励我不断的前进。在此论文完成之际，我向指导了我的导师与师兄致以最衷心的感谢！吴琦老师、韩学易老师在我论文设计及完成过程中，提出了许多宝贵与富有建设性的意见，在此表示感谢！生物化学与分子生物学实验室研究生胥兵、官兴颖、李陈、李成磊、吴正芳、曾民在我实验过程中都给予了极大的帮助与关心，在此，我对他们一并表示最衷心的感谢！最后，感谢我的家人与朋友！他们一直默默地支持我，关心我，鼓励我，是我论文顺利完成的坚强后盾，感谢所有关心与帮助过我的人！
